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清咽功能评价方法修改说明
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  一、承担单位:
四川大学华西公共卫生学院分析测试中心,该单位是国家标准“食品安全性毒理学评价程序和方法”(GB15193)、保健食品检验与评价技术规范(2003年版)等多项国家标准和技术规范的起草单位之一,是卫生部认定的保健食品功能学检验机构,在保健食品功能学评价及其方法研究、相关国家标准与技术规范的起草和方法验证等方面有丰富的经验。

  二、主要工作过程
为了做好技术规范的制定工作,国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司(简称保化司)于2009年4月召开了“保健食品功能评方法及有关程序修订”课题协作组工作会议,参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院东直门医院和国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家近15人,会上对“保健食品功能评价方法及有关程序修订”修订的原则和框架作了充分的讨论,在讨论稿的基础上,又分别征求了相关专家的意见。四川大学华西公共卫生学院分析测试中心于2009年11月牵头成立项目协作组,四川省疾病预防控制中心和湖南省疾病预防控制中心为本项目的协作单位。2009年12月到2010年2月进行了广泛的文献调研和意见征询等前期工作, 2010年2月底召开了《清咽功能评价程序与检验方法》修订课题协作组第一次工作会议,根据前期调研和该课题立项时确定的主要目标和拟修改的主要内容,对促进排铅功能评价程序与检验方法修订的原则以及具体的修订内容等进行了充分的讨论,制定了工作计划、进度安排和初步的修订方案。其后又分别征求了相关专家和检测机构的意见,对修订方案初稿再次进行了修改。
2010年4~8月由四川大学华西公共卫生学院分析测试中心负责,按修订方案进行了动物实验研究。并于2010年8月31日在北京由保化司组织的保健食品功能学评价程序与检验方法修订中期汇报与讨论会上汇报了该项目的进展情况和存在问题。根据动物实验研究结果和中期汇报会上专家的意见,2010年10月召开了《清咽功能评价程序与检验方法》修订课题协作组第二次工作会议,重点讨论了动物试验方法改和指标方面的问题,同时对该功能人体试食试验方法修订的原则以及具体的修订内容等作了进一步的讨论。其后,由四川省疾病预防控制中心和湖南省疾病预防控制中心对该功能检验方法修订方案行了验证。在此基础上形成了《清咽功能评价程序与检验方法(初稿)》,在征求相关专家和检测机构的意见后,对该修订稿再次进行了修改。2011年1月召开了课题协作组第三次工作会议,综合各方意见最终形成了《清咽功能评价程序与检验方法(征求意见稿)》。2011年4月1日在北京由国家食品药品监督管理局许可司组织的、由本单位负责完成的清咽等四个功能方法修改稿汇报和征求意见会上做了详细的汇报,并听取了与会专家的意见。会后又再次征求了相关检测机构和专家的意见,对此“征求意见稿”作了进一步的修改与完善。

  三、编制原则
1.合法性原则:修订工作符合国家相关法律法规并遵循相关管理部门的政策要求。
2. 科学性原则:修订工作遵循科学性的原则,广泛征求相关领域专家的意见并进行文献调研,各项技术指标应具有科学依据并经科学验证。
3. 先进性原则:注意国内管理部门发布的新管理措施,兼顾了技术发展的前瞻性。
4. 实用性原则:从保护公众身体健康的角度出发,充分考虑国情,兼顾我国保健食品功能检测机构的水平,对内容进行客观量化和具体明确化,尽量提高可操作性。
5.协调性原则:尽可能与本规范的其他部分一致,注意合理性与有效性、通俗性和规范性之间的关系。

  四、主要修订内容及新旧规范对比
本修订稿与原规范比较,具体修改部分见下表。


序号

原方法

现方法

修订
理由

序号

内容

序号

内容

  1

(程序)
8.1.1

  动物实验
8.1.1 大鼠棉球植入实验
8.1.2 大鼠足趾肿胀实验

1.1

  动物实验
1.1.1 体重
1.1.2 大鼠棉球植入实验
1.1.3 大鼠足趾肿胀实验
1.1.4 小鼠耳肿胀实验

  实验项目更完善

  2

(程序)
8.2.2

  大鼠棉球植入实验和大鼠足趾肿胀实验任选其一

2.1

  动物实验和人体试食实验所列指标均为必做项目。

  实验项目更完善提高标准

  3

(程序)

  无

2.2

  应对临床症状、体征进行观察。

  尽可能保证判断结果时的客观性

  4

(程序)
8.3.1

  大鼠棉球植入实验或大鼠足趾肿胀实验结果阳性,可判定该受试样品清咽功能动物实验结果阳性

3.1

  大鼠棉球植入实验结果阳性,同时大鼠足趾肿胀实验或小鼠耳肿胀实验结果任意一项阳性,可判定该受试样品清咽功能动物实验结果为阳性。

  更好、更全面的评价保健食品的清咽功能

  5

(方法)
1

  动物实验
动物消炎实验可选大鼠棉球植入实验和大鼠足趾肿胀实验任一种

1

  动物实验
删去

  判断标准已修订,两种方法都要做。

  6

(以下均为方法)
1.1.1

  实验原理
采用棉球等异物动物局部皮下植入,可引起与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽组织增生。然后观察受试样品对肉芽肿重量的影响。

1.1.1

  实验原理
采用棉球作为异物植入动物局部皮下,可引起与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽组织增生。比较给予受试样品后,实验组动物与对照组动物肉芽肿重量的差异,以确定受试样品是否具有干预急性炎症(肉芽肿形成)的作用。

  文字表述更完善,异物限制为棉球,实验更具规范性。

  7

1.1.2

  材料
手术器械、烘箱、天平、注射器

1.1.4

  仪器与材料
手术器械、恒温干燥箱、天平、注射器、乙醚、碘伏、脱脂棉、脱毛器

  更完善

  8

1.1.3

  实验动物
推荐用大鼠,单一性别,体重150-220克。每组8-12只。

1.1.2

  实验动物
推荐使用成年雄性大鼠,体重150-220克。每组8-12只。

  查阅文献所用动物多为雄性

  9

1.1.4

  实验步骤
大鼠在乙醚浅麻醉无菌条件下作切口,将已经称重棉球,经高压灭菌每个棉球再加氯苄青霉素1mg/0.1ml,50°C烘箱烘干后,植入大鼠两侧腋窝下(或两侧腹股沟皮下)。术后随机分为空白对照组和3个受试样品各剂量组。受试样品各剂量组给予不同剂量的受试样品,空白对照组给予溶剂。实验结束当天再给一次受试样品,1小时后将大鼠断颈处死,剥离并取出棉球肉芽组织,于60°C~90°C烘箱内干燥1小时后称重,减去原棉球重量,即为肉芽肿净量。比较各剂量组与空白对照组肉芽肿重量。
肉芽肿净量(mg)=干燥后棉球肉芽肿重量-原棉球重量

1.1.5

  实验步骤
1.1.5.1 棉球的处理 将脱脂棉制成约20~25mg紧致的小棉球,经高压灭菌后,置恒温干燥箱60°C干燥3h,取出无菌条件下称重,干燥保存,备用。
1.1.5.2 肉芽肿的形成和测定
在实验结束前8天,用脱毛器脱去大鼠两侧腹股沟处毛,将大鼠用乙醚浅麻醉,碘伏消毒,在无菌条件下切开大鼠两侧腹股沟皮肤,植入备用的棉球,缝合切口,继续灌胃。实验结束当天再给一次受试样品,1小时后,断颈处死大鼠,在原缝合处剪开皮肤,剥离并取出棉球肉芽组织,置于已称重的洁净平皿,恒温干燥箱60°C开盖干燥1小时后称重,计算肉芽肿净量。
肉芽肿净量(mg)=干燥后棉球肉芽肿重量-原棉球重量

  细化操作步骤,更具操作性

10

1.1.7

  1.1.7 注意事项
1.1.7.1 所用棉球重量可在10~50mg范围内,但同一实验,所用棉球重量应相似。
1.1.7.2由于棉球的表面积对实验结果影响较大,故应使棉球形状和植入部位的形状大小一致以减少差异。
1.1.7.3 动物摄食量的降低和体重减轻,亦可降低肉芽肿重量,故应以mg(肉芽肿)/100g(体重)表示。

6.2

  1.1.7 注意事项
1.1.7.1 所用棉球重量及表面积对实验结果影响较大,故在实验中,应尽可能保证所用棉球重量和表面积近似。
1.1.7.2 尽量使手术切口的大小一致,以减少差异。
1.1.7.3 植入棉球后,将切口缝合牢固,以免在实验过程中棉球脱落,影响实验结果。

  完善

11

1.2.1

  实验原理
用一定量的致炎剂,注入大鼠后肢足趾皮下,造成足趾肿胀,然后测定足趾部厚度,比较实验组和对照组足趾部厚度的变化。

  实验原理
用一定量的致炎剂,注入大鼠后肢足趾皮下,造成足趾肿胀,然后测定足趾容积,比较实验组和对照组致炎剂作用前后足趾容积的变化,以确定受试样品是否具有干预急性炎症(足趾肿胀)的作用。

  与足趾肿胀测量方法修改相一致

12

1.2.2

  材料:游标卡尺(精密度0.02mm)、微量注射器(50μl)。

1.2.4

  仪器和材料:致炎剂(推荐使用葡聚糖4万)、足趾容积测量仪、无菌蒸馏水、0.25ml注射器。

  完善

13

1.2.4

  实验步骤
大鼠按体重分为空白对照组和3个受试样品剂量组,受试样品各剂量组给予不同剂量的受试样品,空白对照组给予溶剂。实验结束当天再给一次受试样品,1小时后,于大鼠右足趾皮下注入1%角叉菜胶0.1ml/只(致炎剂可选用角叉菜胶、琼脂、右旋糖酐等),分别在致炎后1、3、6小时,测量各鼠用足趾容积测量仪测量各组大鼠右后足趾的容积,作为0h足趾容积。然后在大鼠右后足趾皮下注入1%葡聚糖4万0.1mL/只,分别在致炎后1、2、4、6小时测量各鼠足趾部厚度,同一部位测量3次,取平均值。分别比较各剂量组和空白对照组不同时间点足趾部厚度得差异情况。

1.2.5

  实验步骤
1.2.5.1致炎剂的配制 用无菌蒸馏水配成浓度为1%的葡聚糖4万,备用。
1.2.5.2 足趾肿胀及测定 实验结束当天再给一次受试样品,1小时后,用足趾容积测量仪测量各组大鼠右后足趾的容积,作为0h足趾容积。然后在大鼠右后足趾皮下注入1%葡聚糖4万0.1mL/只,分别在致炎后1、2、4、6小时测量各鼠足趾的容积,同一部位测量3次,取平均值。以不同时间所测足趾容积与致炎剂作用前的足趾容积之差为肿胀值,计算各个时间段的足趾肿胀率。
肿胀率(%)=肿胀值/致炎前足趾容积×100%。

  更清晰,更具可操作性

14

1.2.5

  数据处理和结果判定
足趾厚度为计量资料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,则计算F值。若F值< F0.05,结论为各组均数间差异无显著性;若F值≥F0.05(即P≤0.05),结论为各组均数间差异有显著性,需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换,待满足正态分布或方差齐的要求后,用转换后的数据进行统计分析;若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的,则改用秩和检验进行统计分析。
以致炎剂刺激前后足趾厚度的差值变化来表示炎症反应的程度,实验组与空白对照组比较,任一时间点刺激前后足趾厚度的差值明显减少,差异有显著性,可判定该受试样品大鼠足趾肿胀实验结果阳性。

1.2.6

  数据处理和结果判定
一般采用方差分析,但需先进行方差齐性检验,方差齐,则计算F值。若F值< F0.05,结论为各组均数间差异无显著性;若F值≥F0.05(即P≤0.05),结论为各组均数间差异有显著性,需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换,待满足正态分布或方差齐的要求后,用转换后的数据进行统计分析;若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的,则改用秩和检验进行统计分析。
结果判定:实验组与空白对照组比较,任一时间点刺激前后足趾容积肿胀率明显减少,差异有显著性,可判定该受试样品大鼠足趾肿胀实验结果阳性。

  与测量方法修改相一致

15

1.2.6

  注意事项
1.2.6.1 致炎剂若要注入足趾皮下,应将动物后肢拉直,针头刺入足趾中部皮下先向上注射一部分,再调转针头向下注射(共0.1ml)。
1.2.6.2测量足趾厚度时,最好由专人来进行。卡尺紧贴足趾部,但不要加压,否则会影响测量结果。
1.2.6.3 每次测量的部位要固定。

1.2.7

  注意事项
1.2.7.1 致炎剂注入的质量对实验结果影响很大,在注入致炎剂时,应将动物后肢拉直,从右后足掌心向踝关节方向皮下注射致炎剂,并应尽可能使动物不动。建议由专人负责致炎剂的注射,以保证实验结果的一致性。
1.2.7.2 测量足趾容积时,严格按仪器说明操作。注意应在鼠足某处用记号笔画线作为测量标线,将鼠足缓缓放入测量筒内,当水平面与鼠足上的测量标线重叠时,踏动脚踏开关,记录足趾容积,用吸水纸擦干鼠足上的水后,分别再进行第2次和第3次测定。为避免测量误差,测定人员应事先进行训练,掌握将鼠足放入测量筒内的最佳方式,每个样品的测量最好由专人进行。
1.2.7.3 保证每次测定的部位要固定。

  与测量方法修改相一致,更完善。

16

  无

  1.3 小鼠耳肿胀实验
1.3.1 实验原理
二甲苯为无色澄清液体,涂抹于小鼠耳廓后,由于其刺激作用,可引起鼠耳局部毛细血管充血,通透性增加,导致急性炎症。比较实验组和对照组二甲苯作用后耳肿胀率的差异,以确定受试样品是否具有干预急性炎症(小鼠耳肿胀)的作用。
1.3.2 仪器和材料
直径9mm打孔器、致炎剂(二甲苯)、微量加样器、分析天平(千分之一)
1.3.3 实验动物
推荐使用雄性BALB/C小鼠,体重18-22克,每组10-15只。
1.3.4剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组、一个空白对照组和一个模型对照组,三个剂量组中应包括一个人体推荐量的10倍剂量组。受试样品给予时间30天,必要时可延长至45天。
1.3.5 实验步骤
汲取二甲苯20μl,滴加在小鼠右耳外侧面耳廓的中央,让其自由扩散,30min后,将小鼠脱颈椎处死,剪下双耳,用9mm直径打孔器在两耳相同部位打下耳片并称重,以两耳重量之差为耳廓肿胀值,计算耳廓肿胀率。
耳廓肿胀率(%)=耳廓肿胀值/对照耳片重量×100%
1.3.6 数据处理和结果判定
一般采用方差分析,但需先进行方差齐性检验,方差齐,则计算F值。若F值< F0.05,结论为各组均数间差异无显著性;若F值≥F0.05(即P≤0.05),结论为各组均数间差异有显著性,需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换,待满足正态分布或方差齐的要求后,用转换后的数据进行统计分析;若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的,则改用秩和检验进行统计分析。
结果判定:实验组与空白对照组比较,耳廓肿胀率明显减少,差异有显著性,可判定该受试样品小鼠耳肿胀实验结果阳性。
1.3.7 注意事项
1.3.7.1 二甲苯具有对眼及上呼吸道有刺激作用,操作时,操作者应注意自身的防护。
1.3.7.2 打下的耳片应及时称重,以避免水分失去而影响实验结果的准确性。

  新增内容,更好的反映保健食品的清咽功能。

17

2.2.4

  合并有心、脑血管、肝、肾和造血系统等严重疾病及精神病患者。

2.2.4

  合并有心、脑血管、肝、肾和造血系统等严重疾病及精神病患者和有睡眠疾病的患者。

  排除因睡眠问题导致的咽部疾患。

18

2.4

  受试样品的剂量和使用方法
试食组按推荐服用方法、服用量每日服用受试产品,对照组可服用安慰剂,也可用具有同样作用的阳性物。受试样品给予时间15天,必要时可延长至30天。

  受试样品的剂量和使用方法
试食组按推荐服用方法和服用量每日服用受试产品,对照组可服用安慰剂或采用空白对照,也可使用具有清咽功能的保健食品作为对照。受试样品给予时间15天~30天”。试验期间受试者不改变生活、工作环境,不改变原来的生活、饮食习惯。

  更合理

19

  无

2.7

  注意事项
因咽部症状检查带有较大的主观性,建议由专人负责所有受试者试食前后的检查,尽可能保证判断标准的一致性。

  尽可能保证客观性。

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